0 引言

植物染料，作为自然界中重要的天然染料，种类丰富、色彩绚丽，用于纺织品染色历史悠久。苏木（Sappanwood，也可统称为Brazilwood），公元前2世纪在亚洲记录用作染色使用^[1]，在丝织品上色牢度较差，光照下很容易褪色^[2]。苏木属于可溶性红木，呈红色组分主要为高异黄酮类巴西苏木素及氧化产物苏木红素^[3-4]。作为中国传统染红植物染材，苏木在中国染织史上占有重要的地位。最早记录于晋代嵇含所著《南方草木状》“南人以染绛”，唐代起越发重要，到了宋代随着海外贸易繁盛大放异彩，明朝时成为染制国色的关键染料，清代达到应用巅峰，与蚕丝配伍体现“丝绸之国”的重要意义^[5]。对于有色织物来说色差的变化是判断保存状况的重要依据，对于博物馆馆藏文物预修复具有重要的指示作用。

天然染料通常为复杂基质，除显特征颜色组分外还含有大量非必要显色组分。高效液相色谱法分析用量少，可从样品边缘获得残丝，不会给文物带来很大损失，近似微损^[6]。无论在考古挖掘还是馆藏文物分析上具有重要的研究应用^[7]。

光老化是博物馆中文物褪色的主要因素^[8]，由于有机染料分子降解过程非常复杂，那些附着在文物上对光特别敏感的染料鉴定如果发生褪色，鉴定起来尤为困难^[9]。大量的颜色学体系采用反射光谱无损检测技术建立去研究颜色的变化^[10]，但关于副产物小分子的报道鲜少。通过光谱和色谱技术联用可以灵敏地对老化过程及组分变化提供完整信息^[11]。同时如果借助更多表征手段如有机质谱分析技术和核磁共振技术，可相互验证辅助鉴定^[12]。

有机质文物如书画和纺织品在修复保护过程中常常遇到褪色问题，对于染料分子是一种不可逆的损伤，也是该研究领域难以摆脱的重要瓶颈，因此有必要采用一定的科学方法对原因机理进行研究。近期研究发现在一幅清代书法作品上苏木用于红色颜料涂刷在纸张上用作粉笺纸，边界大面积褪色但仍能检测到两种有效组分巴西苏木素和原苏木素B^[13]。借此研究契机，本研究全面追踪了巴西苏木素和原苏木素B在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）基质里光催化老化代谢过程，主要采用液相色谱质谱联用技术监测了反应中间体及老化变化过程。采用组学方法结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型，分析17组苏木染丝不同老化程度的变化组分差异。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

1）实验材料。苏木购于北京同仁堂药店。十二水硫酸铝钾购于天津市大茂化学试剂厂，分析纯。染色用纺织样品，购置大兴纺织，经红外检测与标准谱库比对确认为桑蚕丝。染色前温煮1 h除去蚕丝织物精炼产生的杂质。巴西苏木素和原苏木素B标准品分别购自百灵威科技和国药集团，纯度分别为98%和90%。

2）老化设备。采用东莞利鑫仪器设备有限公司UVA-340紫外耐候试验箱，光源采用UVA-340紫外线灯管，光源波长340 nm，光源功率15 W，置放试样用网架规格63 cm×34 cm，内箱尺寸70 cm×35 cm×30 cm。

3）紫外反射光谱。采用PerkinElmer Lambda950台式紫外可见近红外分光光度计，光谱范围为可见区，波长范围380~780 nm，步进波长1 nm，采用钨灯光源、光电倍增管（PMT）检测器、150 mm积分球。反射光谱的绘制，根据样品相对于白板（BaSO₄）反射光谱信号比值，即相对反射系数R及一阶导数值dR/dλ，在可见区绘出反射光谱图，采用D65光源，10°观察角同时根据CIELab标准读取特征颜色值。为提高结果准确度，每个样品重复3次测量取平均值。

4）核磁共振。采用布鲁克400 MHz核磁共振仪，DMSO-d6作为氘代溶剂，获得¹H谱。化学位移值以四甲基硅烷（Tetramethyl silane，TMS）作为内标，偶联常数（J）以Hz为单位。使用如下缩写:s（单重峰）; d（二重峰）; dd（双二重峰）; m（多重峰）。

5）超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱。液相条件采用Waters Acquity H-Class UPLC进行测试，BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）色谱柱; 柱温30℃; 流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈; 梯度条件:0到0.3 min保持95%A，到9.3 min，A相变为5%并保持1 min，然后回到初始流动相平衡1.5 min; 流速0.25 mL/min; 进样量均为2 μL。质谱条件采用Waters Xevo G2-XS Q-TOF MS进行测试，质量扫描范围m/z 50~1200; 采用全信息串联质谱方法（MS^E）进行数据采集。ESI电离源，源温:120℃; 脱溶剂气体为氮气，脱溶剂气体温度为450℃，流速为800 L/h; 毛细管电压为3 kV，锥孔电压 40 V，碰撞能量20~40 eV。采用亮氨酸脑啡肽作为实时校正液，浓度为0.4 ng/L，每隔30 s进样一次。整个系统由Waters MassLynx软件进行控制，实验数据采用ApexTrack积分方法由Waters UNIFI软件进行处理。

1.2 实验方法

苏木染色实验采用前媒染法根据相关报道制备^[14]，整体实验流程如图1所示。将1.8 g白布（图1a）放入明矾水溶液（1.56 g明矾溶于100 mL纯水制成浓度为33 mmol/L）中，60℃煮1 h。称取11.0 g苏木，置于40~50℃ 500 mL纯净水中约30 min，再温度升至95℃保持60 min，筛网过滤除去残渣，染液浓缩蒸发至约200 mL后将白布从明矾水溶液中取出，测得此时明矾水溶液的pH大约为5，拧干后放入过滤好的染液中（浴比1∶20），在80℃下保持60 min并不断搅拌（图1b）。将染色的布取出，用纯净水清冼两次，置于通风良好的环境中晾干（图1c）。将染色样品及空白分别剪裁成长宽各为4 cm标准小样，分别为16块，将每一块染色小样和空白小样作为1组，共16组，每隔1周从老化箱中取出1组，进行连续老化（图1d），老化前后对比如图1e和图1f所示。同时进行单体溶液光照老化实验，将巴西苏木素和原苏木素B分别溶于DMF，进行光老化，定期取样进行液质检测。不同样品编号及对应老化时间见表1。

2 结果与讨论

2.1 颜色变化反射光谱无损检测分析

反射光谱如图2a所示，变化规律基本一致。对dR/dλ进行一阶求导后得到一阶导数光谱图（图2b），纵坐标代表反射率随波长的变化率，样品从800到550 nm反射率降低，在600 nm附近反射率曲线降低最快，最大吸收峰位呈蓝移变化。明矾前媒染法苏木之所以染出红色是由于苏木红素（brazilein）和金属铝的络合作用而产生^[1，13]。随着样品不断光老化程度加深逐渐发生褪色，显色组分苏木红素（brazilein）逐渐降解，C9位羰基官能团导致的电子离域作用减弱^[15]，因此最大吸收波长总体发生蓝移，造成颜色的改变。降解褪色曲线如图2c所示，除个别样品（R2和R7）可能存在老化时放置相对位置差异造成老化过强，反射率总体呈下降趋势，因此颜色变淡。17组不同程度光老化苏木染丝样品的颜色值记录、一阶求导最大吸收波长及反射率见表2。

（续表2）

2.2 巴西苏木素的降解研究

巴西苏木素结构性质上属于典型的高异黄酮类化合物（homoisoflavonoids），呈琥珀黄色，在分子结构上和苏木精非常相似，因此化学性质也极为相似。Lalor等发现氧化苏木精在强酸强碱中均不稳定，考虑到这些因素实验中选择DMF这种沸点较高、溶解性好的溶剂进行溶解^[16]。鉴于高强度的光老化条件，DMF作为甲基化试剂参与了部分反应。负离子模式对于黄酮类化合物具有较好的灵敏度和响应^[12，17]，Peggie博士在对苏木鉴定时也印证了这一点^[18]，因此本质谱实验均采用负离子模式。由于邻位取代的二酚基团的存在，巴西苏木素有很强的还原性，很容易被氧化成更强的着色物质苏木红素（m/z 283，[M-H]^-）产生深红色^[19]。两者均为四元环结构，均含有两个芳香环（A环和B环）、一个吡喃酮六元环（C环）和一个五元环（D环），植物体内生物合成途径中与吡喃酮环相连的芳环来源于乙酸酯代谢，而与五元环相连的芳环由莽草酸代谢路径产生^[15]。实验发现苏木红素作为巴西苏木素的氧化产物，在最初未老化样品中即存在。巴西苏木素和苏木红素分别在B12和B14时降解完毕。巴西苏木素参与到的降解反应如图3所示。

首先初步采用核磁共振对巴西苏木素在氘代试剂中光照下产生的初步变化进行检测（图4），以期找到反应的活性位点。巴西苏木素氢谱归属如下:¹H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 9.22（s，1H），8.60（d，J=7.6 Hz，2H），7.12（d，J=8.3 Hz，1H），6.62（s，1H），6.52（s，1H），6.40（dd，J=8.3，2.3 Hz，1H），6.19（d，J=2.3 Hz，1H），3.86~3.80（m，2H），3.55（d，J=11.3 Hz，1H），2.86（d，J=15.6 Hz，1H），2.68（d，J=15.7 Hz，1H），2.08（s，1H）。δ 2.50为氘代溶剂峰。除此之外两个显著的单峰（δ 5.27和3.34）分别为溶剂中杂质峰:前者为二氯甲烷，后者为HDO由氘代试剂发生分子间慢交换引起的^[20]，高温老化后发生挥发即消除。δ 2.08，积分值1.15的氢峰为季碳上偶联的羟基氢^[21]，即五元环和六元吡喃环相连的C11位置。经过老化后峰明显消失，猜测发生了脱水反应。δ 9.22的单重峰归属于A环上的酚羟基，δ 8.60的二重峰归属于B环上的两个邻位酚羟基，均属于活泼氢，高温老化产生分子内氢键，没有再出明显的峰。根据核磁追踪到的特征老化行为，接下来结合液质老化数据对结构进行推测。

从B1就开始产生直到B17，负离子模式质荷比m/z 265比较显著地产生一组Type B型化合物（Bra’），归属于苏木红素脱氢类产物（图5），Karapanagiotis等^[12]最初在研究克里特岛学校图标时发现用到的可溶性红木中存在这些化合物，但是这类结构并没有明确。Peggie博士^[18]也提议是苏木红素中的叔醇的催化消除产物，本研究间接证明脱水机制无需酸处理即可发生。同时还可检测到吡喃酮环和五元环间开环形成中环（9元环）化合物苦木素P（m/z 299），在开始老化样品中即产生，非常容易形成。巴西苏木素分子中含β-羟基含氧双环结构，样品在老化箱中老化过程中具备的高温高压条件，促使发生开环形成环酮化合物^[22]。

分子离子峰质荷比为m/z 307的同分异构体的两个分子离子峰在最初样品B0不存在，是从B2开始产生老化全程存在，保留时间是2.83 min和2.99 min（为主）。随着老化时间的加长，峰面积均逐渐加大，至老化139.25 h，B9中保留时间2.95和3.16 min色谱峰面积相当。老化到样品B10，巴西苏木素的色谱峰（3.19 min）降解非常明显，如图6所示。根据Jung和Kim报道的全合成路线^[23]，即二羟基化中间体和羟基保护剂2，2-二甲氧基丙烷（2，2-DMP）发生酸催化环化反应形成巴西苏木素核骨架，苏木酚可能作为前体原料参与到了合成的反应，在反应过程中也检测到了苏木酚的存在，猜测产生的m/z 307为与苏木酚结构相关的双键还原产物。因此，在DMF弱碱性条件逆向开环反应可能产生检测到的这种物质的分子离子。

对于编号B6~B10样品，变化规律较为一致（图7）的特征段为保留时间分别在3.92，3.99，4.06，4.14 min分别产生分子离子峰m/z 358，283，299，289（以B9为例）。根据含氮规则，m/z 358可能为巴西苏木素和DMF的加合产物; 分子离子峰m/z 283为苏木红素，对于B6色谱峰峰面积相对较高，至B9和B10时色谱峰峰面积次之，前者m/z 358的色谱峰峰面积相对较高。分子离子峰m/z 299为酚羟基的甲基化产物，生物体内通常由3’-O-甲基苏木酚或其C4位差向异构体生成3’-O-甲基巴西苏木素^[24]。巴西苏木素在植物体内的合成通过采用2’-甲氧基茶尔酮，4位羰基发生加氢反应生成羟基官能团从而形成苏木酚或者表苏木酚差向异构体，这是其生化合成的关键一步，接下来在一定的酸碱催化下或者直接在中性条件加热很容易生成^[24]。苏木酚发生开环脱氢产生分子离子峰m/z 289，还可以检测到继续脱水形成查尔酮类化合物（m/z 271）。根据Abegaz等^[3]的报道，巴西苏木素在生物体内可由高异黄酮类前体生成，并在文章中提到Dewick等发现苏木查尔酮可作高异黄酮类前体化合物的生物合成反应物，并且成功推导出转化成巴西苏木素的模型。这是一个六元环开环形成苏木查尔酮，分子结构中有一个酚羟基为甲基取代物形成甲基醚，m/z 303到m/z 289失去CH₂即14的分子量，为脱甲基化的过程。反应为动态反应，没有追踪到甲基醚的中间产物。

2.3 原苏木素B的反应变化

苏木中含有许多结构类型的酚类化合物，原苏木素B属于二苯佐辛类（dibenzoxocins）。整个降解反应如图8所示，光催化下倾向于有机小分子加成反应。

原苏木素C（m/z 301）在P1时即开始产生一对旋光异构体（以P2为例，3.38和3.51 min），同时观察到从P1到P17产生分子离子峰为m/z 374的新物质（RT3.63，4.12，4.35 min），根据氮素规则，产生的原苏木素C很容易和DMF发生羟醛缩合反应生成半缩醛，RS手性构形组合产生三种不同手性的化合物即3个峰。由于原苏木素C空间位阻较大，没有检测到继续反应生成稳定的缩醛。产生的原苏木素C和体系中原苏木素B的仲碳醇发生羟醛缩合产生分子离子m/z 605（3.71和3.82 min），至P6时，m/z 605又多出两个保留时间（3.93和4.05 min），为原苏木素B的季碳醇和原苏木素C的羟醛缩合产物。溶剂DMF在这个过程中也存在老化降解，脱甲基化产生甲酰胺。质荷比为m/z 605的峰分子中两个醇羟基发生甲基化作用生成甲基醚类化合物m/z 633（4.76 min），基于P5时就已经产生且为单峰，反应活性位点推测为分子结构中两个叔醇位发生甲基化的产物。原苏木素C自身发生二聚生成分子离子m/z 603（4.45和4.55 min）。原苏木素C自身能够发生醛的三聚反应，从P2至P19产生分子离子m/z 905（4.63 min），至P10时浓度最高，随后受反应体系空间位阻的影响逐渐减少。至P12时，原苏木素B基本降解完毕，m/z 605和m/z 603的对应的六种物质峰基本消失，原苏木素C的三聚体及甲基化产物m/z 633仍存在。实验中发现原苏木素B还会发生开环及脱水反应，在保留时间3.48 min和3.34 min分别产生分子离子m/z 291和m/z 273。反应过程产生的中间体的液相色谱结果如图9所示。

随着老化的进行，会有少量的尿石素C生成（图10以P6为例，RT4.12 min，m/z 243），主要从P2至P13产生，至P6时产生强度相对较高，这在最初原苏木素B中是检测不到的。尿石素C属苯骈α-吡喃酮（即香豆素）类化合物，已证实在植物体内存在^[2]，作者在日常检测过程中发现对于苏木染褪色文物其通常是主要成分。通过对原苏木素B的老化实验，原因得已证实。除苏木自身含有外，原苏木素B在光老化过程也会生成，可作为一种非特征显色组分鉴定标志物对苏木染文物进行指认。

2.4 苏木染丝织老化品的主成分分析研究

对苏木染丝织品进行组学分析，QC为R0~R16所有样品提取液的混合样，以所有QC为一组（condition 1），以R0~R10为一组（condition 2），R11~R16为一组（condition 3）进行主成分分析（PCA）。QC样品在整组数据中比较聚集，说明整个系统平衡性较好。选取QC4作峰对照。原色未老化样品R0同16组老化样品可以明显区分，同时老化样品可以总体上分成两组趋势:R1~R10可分为一组（Group1），R12~R16可分为一组（Group2）; R11居中偏向于后一组，可看作光老化的两个剧烈变动过程的过渡。为了能够找到两组的差异，对样品强制分组。建立OPLS-DA模型作统计学分析，在S-PLOT图中寻找VIP＞1的差异组分。检测到两组间差异倍数大于2倍的主要差异代谢组分有巴西苏木素、原苏木素B、原苏木素C、3’-去氧苏木酚、苏木红素、原苏木素E、7，3′，4′-三羟基高异黄烷、5，7-二羟基-4’-甲氧基异黄烷酮、苏木查尔酮。原苏木素E是巴西苏木素和原苏木素C的羟醛缩合产物，表3中原苏木素E1和原苏木素E2为原苏木素E的两种不同构型（R或者S型），原苏木素C1和原苏木素C2同样为原苏木素C的两种构型单体。这些成分在两组间存在明显差异，在褪色明显的Group2样品中含量明显减少。差异倍数大于1倍小于2倍的差异组分是苏木苦素P和尿石素C，说明降解得相对不那么严重。植物自身体内许多成分存在着相互转化，通过模拟实验发现巴西苏木素和原苏木素B分别可转化成苏木苦素P和尿石素C，这两种成分在苏木植物体内及其上染丝织品上也存在，虽然不是显色组分，但是在老化样品中显著存在，影响着整体苏木染丝织品的色泽体系变化。

（续表3）

3 结论

通过苏木染色模拟光老化实验，对文化遗产中主要常用的天然染料苏木染纺织品进行光褪色机理研究。苏木染丝织品极易发生光老化褪色，反射光谱一阶求导发现随着老化的进行最大峰位总体发生蓝移。在老化产物上，分别采用两种单体标准品巴西苏木素和原苏木素B进行动力学老化分析，通过实时监测研究溶液状态下动力学体系变化。结果发现巴西苏木素主要反应活性位点在季碳羟基容易发生脱水反应，结构中五元环容易开环; 原苏木素B在老化过程中主要发生去氢反应、聚合反应，两者在老化过程中分别会产生苏木苦素P和尿石素C。对苏木染丝织品进行组学分析发现，原色未老化样品与不同程度老化样品有较大差异，不同程度的老化样品间通过主成分分析呈现两组趋势。通过建立OPLS-DA模型寻找差异代谢物，检测到两组的主要差异组分包括巴西苏木素、原苏木素B及原苏木素C在内的多种老化产物，整体对苏木染老化丝织品的颜色变化产生影响。其中苏木苦素P和尿石素C作为老化产物同时也是苏木上染组分，相对降解不严重，可作为非显色组分鉴定标志物有助于今后苏木染褪色文物的鉴定。这些探索性发现期待为今后天然染料的相关研究提供启发，助力提升有机质文物的科学价值认知。

参考文献