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0 引言
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真菌[1]的定殖和生长代谢会引起铅丹等矿物颜料变色[2]、动物胶等有机胶结材料降解失效[3]，以及随水盐运移产生的酥碱、粉化、空鼓等病害问题[4]，是影响墓葬壁画稳定保存的重要因素之一。墓葬壁画表面常见真菌类群包括青霉属、曲霉属、枝孢属、链格孢属[5]等，其菌落组成主要与环境湿度、生物可利用水、温度、光照、文物材料的生物接受度和生物易感性有关[6]，各因素的差异性将影响霉菌形貌特征、发展态势、损害机理和治理方式。目前针对墓葬壁画霉菌的治理方法包括机械清除、物理方法和化学方法等，但机械方法存在破坏壁画基质且清除不彻底的问题，高温/紫外线辐照与激光清洗则缺少充分的实验数据支持其大规模的应用，常用的季铵盐类、酚类、醇类、酯类、天然提取物等杀菌剂也因生态毒性、微生物抗药性等原因在壁画霉菌病害治理上仍有诸多限制[7-9]。因此现阶段对杀菌剂有效性和长效性的科学性评估及治理方式的联合应用研究尤显关键。
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墓葬壁画处于空气流动性差、空气相对湿度高的地下环境时，极易导致霉菌病害，故将其保护性搬迁至博物馆前需先对霉菌病害进行灭菌处理，此阶段的治理效果也直接决定后续修复阶段的霉菌生物活性与菌落组成。故本研究以韩休墓壁画霉菌病害为研究对象，重点关注搬迁阶段霉菌治理方式对现修复阶段菌群发展、演替的影响，以此评估搬迁阶段所采用杀菌剂的有效性和长效性，并结合霉菌病害调查、保存环境监测数据以探讨修复阶段霉菌病害成因，最后综合上述成果为韩休墓壁画后续保存、展示提供有针对性的霉菌治理方法，并为墓葬壁画揭取搬迁、存放、修复、展示等不同阶段霉菌防治工作的相洽性与协作性研究提供参考。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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1.1.1 样点简介
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唐韩休墓位于西安市长安区郭庄村南100 m处，为长斜坡墓道多天井单室砖石墓，墓葬墓道、甬道、墓室皆绘制精美壁画，其中以墓室南壁《朱雀图》、北壁《山水图》、东壁《乐舞图》幅面阔大，内容丰富，价值最高[10]。该墓葬于2014年3月被发现，2014年12月至2015年7月完成18幅小型壁画的揭取搬迁工作，2015年8月至11月完成上述3幅大型壁画的整体搬迁工作。
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1.1.2 样品采集
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2022年5月，在进行韩休墓3幅大型壁画表面封贴材料去除工作时，发现壁画表面滋生有大量黑色与黄色霉菌，同年10月即对《山水图》《乐舞图》两幅壁画中的黑色、黄色霉菌分别进行样品采集。采样前预先将采样管、采样盒、手术刀高温灭菌，采样时使用一次性无菌棉签沿单一方向轻轻擦拭壁画表面霉斑部位，然后将带菌棉签置于无菌采样管、采样盒中，标明采样编号与时间，带回实验室进行分离培养。同时还收集有带霉菌壁画残块用于壁画层位结构及霉菌病害特征分析。
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1.1.3 培养基、主要试剂和仪器
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供试培养基：沙保罗琼脂培养基（SDA），用以真菌的分离纯化，重庆庞通医疗器械有限公司生产。
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主要试剂：Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、溶菌酶缓冲液、真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’），上海生工生物公司生产；DNA Marker DL 2000、Taq DNA聚合酶、Loading Buffer，TakaRa公司生产；琼脂糖（BIOWEST）、电泳缓冲液。
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主要仪器：空气温湿度测量仪，德国testo公司生产；VHX-5000型超景深三维显微系统，日本KEYENCE公司生产；Finnpipette微量移液枪，上海赛默飞世尔仪器有限公司生产；SW-CJ-IFD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司生产；KBF240型恒温恒湿箱，德国Binder公司生产；C1000型PCR扩增仪、Gel Doc 2000型凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司生产；IMS-50全自动雪花制冰机，常熟市雪科电器有限公司生产；Allegra64R高速冷冻台式离心机，美国贝克曼库尔特股份有限公司生产。
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1.2 方法
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1.2.1 现场病害调查
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依照WW/T 0061—2014《可移动文物病害评估技术规程馆藏壁画类文物》、WW/T 0006—2007《古代壁画现状调查规范》等相关规范及要求，对韩休墓3幅大型壁画进行霉菌病害现场调查，重点记录霉菌病害形貌特征、分布状况以及各类霉菌与壁画颜料层、石灰地仗层的结合关系。
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1.2.2 超景深显微观察
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采用超景深三维显微系统对韩休墓3幅大型壁画掉落的带霉菌壁画残块表面及剖面进行微观形貌观察，检测环境为室内自然环境，镜头为VH-Z20R镜头，倍率范围为20倍至200倍，观察距离为25.5 mm。
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1.2.3 霉菌分离鉴定
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1）分离纯化
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无菌条件下，将带菌棉签头用无菌剪刀剪下，放入SDA培养皿中，在28℃，RH 80%的恒温恒湿培养箱中倒置培养72 h，选择分离效果明显，菌落形态、颜色多样的平板，分别挑取单菌落进行划线纯化，分离2~3次。纯化得到的菌株置于-20℃保存备用。
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2）分子生物学鉴定
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对纯化得到的菌落进行培养，采用DNA提取试剂盒对真菌总DNA进行提取。真菌PCR的扩增采用ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR扩增反应体系采用50 μL：10×PCR缓冲液5 μL、MgCl2（25 mM）5 μL，dNTP（2.5 mM）4 μL、Taq酶（5 U/μL）0．4 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 31．6 μL。PCR反应条件为95℃预热3 min，95℃变性60 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环，然后72℃终延伸10 min。反应结束后，取PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时委托上海生工生物公司对其进行序列测定。将测序所得的序列结果在NCBI中进行BLAST比对，采用以下标准：s≥99%为同种，95%＜s＜99%为同属，以此判断待测微生物的种属（s表示待测序列与数据库中序列的相似度），使用Mega7软件构建系统发育树。
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1.2.4 霉菌病害防治历史调查
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根据韩休墓壁画搬迁阶段保护修复档案、视频等相关资料记录，进行霉菌病害防治历史调查，调查内容主要包括病害发生时间、病害特征、病害成因及采用的治理方法等。
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1.2.5 库房保存环境监测
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为配合韩休墓出土壁画保护项目，库房安装有空调、除湿器等温湿度调控设备以维持环境温湿度稳定，并采用温湿度测量仪监测库房内温度和相对湿度变化，数据记录频次为每日2次（9点、17点各1次），本研究选择2019年12月至2020年6月此半年环境数据进行分析。
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2 结果和讨论
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2.1 修复阶段壁画霉菌病害特征与鉴定
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2.1.1 霉菌病害特征
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由现场病害调查及超景深显微观察结果可知，黄色霉菌主要存在于壁画表面封贴纱布上（图1a），分布位置集中在画面中下部，呈粉状堆积状（图1b），依附封贴胶料、纱布与壁画本体连接，同壁画结合不紧密，用手术刀轻轻刮取即可与壁画分离；黑色霉菌则均匀分布于壁画整体，呈丝态团聚状（图1c），霉菌滋生周围有明显棕色、黄色菌斑（图1d），由壁画剖面显微照片（图1e）可知，黑色霉菌菌丝体已深入壁画石灰地仗层与泥质地仗层孔隙内部，且石灰地仗层霉菌富集区域已出现糟朽酥碱病害（图1f）
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图1 壁画微生物形貌特征观察
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Fig.1 Observation of microbial morphological characteristics in murals
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2.1.2 霉菌样品的分离与鉴定
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1）采集及分离纯化结果
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通过分离培养，4个霉菌样品共分离纯化出霉菌11株（图2），依次编号为1-11，根据菌落形态、颜色初步分为A类（菌株1、3、7、10）：质地绒状，菌落呈蓝绿色，表面有规则放射状沟纹，培养皿内有黄色渗出液；B类（菌株2、5）：质地绒状、菌落中心呈蓝绿色，边缘菌丝体为白色，培养皿内有黄色渗出液；C类（菌株4、8、9）：质地绒状，菌落呈白色，表面有不规则放射状沟纹；D类（菌株6）：质地绒状，菌落呈环状，由中心至边缘依次为黄色、蓝色、白色，边缘为绒毛状；E类（菌株11）：质地绒状，呈黄绿色，表面中心突起，有规则放射状沟纹，培养皿内有大量黄色渗出液。
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2）分子生物学鉴定结果
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将11株霉菌的ITS序列与Genbank数据库中收录的序列进行同源性对比，构建韩休墓壁画霉菌样品中分离真菌系统发育树，由图3可知，11株霉菌归属青霉属（Penicillium）与枝孢属（Cladosporium）2个属，其中黑色霉菌分离菌株均为青霉属，黄色霉菌分离菌株则是两者兼有。
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青霉菌是墓葬、石窟壁画中的常见菌种，陕西长安南礼王村唐代韦氏家族墓[11]、敦煌莫高窟[12]、嘉峪关魏晋墓、河南密县汉墓[13]、打虎亭汉墓[14]、南唐二陵[15]、日本高松冢古坟[16]、西安曲江翠竹园西汉墓[17]等壁画中均分离、鉴定出青霉菌，且大部分都为优势菌。青霉菌属半知菌类丛梗孢科，种类众多，分布广泛，是土壤和空气中的常见菌，其营养来源众多，可生长在任何含有机物的基质上，且菌丝发达，故极易进入壁画内部，以壁画材料中的植物纤维与动物胶料为食，引起壁画的结构性损伤，是壁画最为普遍的有害菌之一。
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样品青霉菌中又以产红青霉（Penicillium rubens）、柠檬黄青霉（Penicillium citreosulfuratum）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）相对丰度最高。产红青霉和柠檬黄青霉在壁画霉菌中较为少见，严淑梅在古代丝绸霉害微生物类群调查时发现，西北地区四季分明，较干旱、寒冷，日温差大，霉菌类群多见各种稀有青霉[18]，本研究分离鉴定出的产红青霉、柠檬黄青霉、Penicillium dipodomyicola即属此类；产黄青霉则为广布种，在敦煌莫高窟、河南密县汉墓、打虎亭汉墓等多处壁画中皆有发现，枝孢属的球孢枝孢霉（Cladosporium sphaerospermum）也较常见于壁画中，在敦煌汉墓、嘉峪关五号墓壁画[19]都有检出。
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图2 样品涂板及分离菌株单菌落形态图
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Fig.2 Sample plates and single colony morphology of the isolated strains
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图3 壁画霉菌样品分离真菌系统发育树
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Fig.3 Phylogenetic tree of fungi isolated from murals
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2.2 搬迁阶段壁画霉菌治理方式评估
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韩休墓自2014年3月考古发掘，至2015年3月墓室清理期间，共发生过3次大规模霉菌病害，为有针对性地制定霉菌防治措施，马艺蓉等[20]曾对墓室南壁、东壁、北壁表面和墓室四角采集的壁画、空气霉菌样品进行过分离、鉴定，结果表明韩休墓壁画搬迁阶段的霉菌优势菌种为青霉菌、曲霉菌，还有少量镰刀菌和交链孢菌。
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为防止墓葬再次发生大规模霉菌病害，保护人员将霉敌与克霉唑两种乙醇溶液混合使用，以每周两次的频率喷洒于壁画表面和墓室空间，取得了较好的防霉效果[20]，霉敌与克霉唑均为高效、低毒、广谱防霉剂，对各类霉菌皆有较强的抑制作用，将两者混合使用，能有效避免长期使用单一类抑霉剂所产生的霉菌耐药性，提高防霉效率。因此，直至3幅大型壁画整体搬迁完成时，墓室内再未出现明显的霉菌滋生扩散现象。
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搬迁后的壁画存放于陕西历史博物馆库房，库房安装有空调、除湿器等温湿度调控装置，用以维持库房环境温度与相对湿度的稳定。由图4库房温度与相对湿度变化情况可知，上述温湿度调控装置可有效控制库房空气温度与相对湿度，减缓其随室外季节温湿度变化的幅度，使库房温度基本维持在10~25℃，相对湿度则整体低于60%。
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图4 库房温度与相对湿度变化
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Fig.4 Variations of temperature and relative humidity at the warehouse
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对比韩休墓壁画揭取阶段与修复阶段霉菌菌落组成可看出，由于壁画揭取阶段的防霉处理措施以及运移至博物馆库房后稳定低湿的保存环境，修复阶段壁画表面霉菌多样性显著降低，曲霉菌、镰刀菌、交链孢霉得到有效抑制。防霉处理所用的克霉唑虽为广谱防霉剂，但对不同菌株仍呈现出差异化的防治效果。郑伟伟等[21]曾测试过克霉唑对聚多曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、黄曲霉、产黄青霉、P． hispanicum等曲霉、青霉属霉菌的生长抑制效果，证明克霉唑对曲霉属菌株的抑制效果要略强于青霉属菌株，且曲霉属更好高温，10~25℃的库房温度并不利于其萌发滋生，因而在保护修复阶段未能检出曲霉属霉菌。同时，两阶段青霉菌菌落组成也产生了较大变化，防霉剂的使用、保存环境的变化影响了壁画表面微生物群落的演替，一些更易着生于高湿度、且温湿度变化频繁环境条件的青霉菌，如搬迁阶段的椭孢青霉，由于缺少了生长繁殖的适宜条件，即被其他类型的青霉菌取代。新出现的产黄青霉则应与壁画表面盐析现象有关，壁画整体搬迁前采用炭火进行烘烤，使壁画内部水分蒸发，盐分迁移至泥质地仗层与石灰地仗层，壁画表面含盐量增加，而产黄青霉菌株具有极强的耐盐性，在25%NaCl盐溶液时仍可生长。此外，保护修复阶段还出现了一新种属——枝孢属，枝孢属霉菌相较于交链孢属等好湿性霉菌，对环境湿度要求较低，孢子在50%~60%即能萌发[22]，因此即使保存于低湿库房中，也可滋生蔓延。
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2.3 壁画修复阶段霉菌病害成因分析
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综合霉菌病害调查与分子生物学鉴定结果可知，韩休墓大型壁画霉菌病害具有以下特征：
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1）壁画表面滋生的黑色与黄色霉菌具有显著的组成、分布差异，其中，黑色霉菌菌株类别均为青霉属，在壁画表面和石灰地仗层、泥质地仗层中皆有分布；黄色霉菌则包括青霉属与枝孢属两种，主要依附壁画封贴纱布存在；
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2）壁画表面霉菌富集区域出现棕色、黄色菌斑等微生物污染病害（图1d）。壁画内部黑色霉菌富集区域出现较为严重的酥碱病害（图1f）。
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韩休墓大型壁画整体搬迁时，为提高壁画本体与表面封贴材料的粘结强度，同时避免霉菌的重新定殖，采用了20%B72丙酮溶液作为胶粘剂贴刷纱布，并以塑料薄膜覆盖于壁画之上，使壁画始终处于相对密封的状态，故库房存放期间滋生的霉菌主要来自壁画石灰地仗层、泥质地仗层中原本存在的菌丝体以及包装过程中落于壁画表面的霉菌孢子，形貌上表现为黑色霉菌与黄色霉菌。其中，黑色霉菌由青霉菌组成，青霉属真菌能产生有机酸[23]、色素、纤维素酶等代谢产物，色素附着于壁画表面，可使壁画出现棕色、黄色等菌斑，影响壁画美观度；黄色霉菌由青霉菌与枝孢菌组成，枝孢菌是典型的腐霉，现场调查亦发现其富集区域依附的封贴纱布大多腐烂分解，同时，枝孢菌还会以壁画颜料中的动植物胶为营养源，在生长代谢过程中分解壁画胶料，降低颜料颗粒之间的黏结力以及颜料与石灰地仗层之间的结合度[24]，引起壁画颜料粉化脱落，使画面色彩度降低。
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壁画酥碱部位出现较多黑色菌丝体物质，而无明显酥碱病害的壁画样品中则未发现菌丝体结构，表明青霉属真菌与壁画酥碱病害的相关性。马文霞等在敦煌、嘉峪关等三座墓室酥碱砖壁画中皆检出产黄青霉则进一步证明产黄青霉与壁画酥碱病害的直接关联。产黄青霉耐盐性强，可生长于壁画富盐表面，其产生的葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸等有机酸又可与壁画石灰地仗层（主要成分为CaCO3）反应，生成可溶性Ca（HCO3）2，致使壁画石灰地仗层软腐，同时外界湿度的变化，以及封护材料塑料薄膜对韩休墓壁画表面含水率的限制，都会造成壁画表面可溶盐溶解-重结晶的反复作用，加重壁画酥碱，产黄青霉产生的纤维素酶[25]还可分解地仗层中的麦草纤维，降低壁画结构强度，持续影响壁画的稳定性。
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2.4 后期霉菌病害治理方法探讨
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由于韩休墓壁画上的霉菌既覆盖壁画表面形成大面积霉斑，又深入壁画内部影响壁画地仗材料的稳定，同时伴有酥碱、变色等其他病害，因此治理时需兼顾表面霉菌清除、内部菌丝体杀灭以及霉菌预防等多个方面。
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表面霉斑清除时，考虑到韩休墓壁画颜料层与石灰地仗层之间的结合较为脆弱，因此在清除方法选择上应以最小引入与最小干扰为主，并需根据黑色霉菌与黄色霉菌在分布位置、霉菌与壁画结合程度以及霉菌病害机理的不同而采取有针对性的清除方法。其中，黄色霉菌因主要依附于封贴纱布上，与壁画本体结合较为疏松，故可先对壁画封贴材料进行揭除，伴随着封贴纱布的揭除与胶粘剂B72的清理，大部分黄色霉菌亦能随之去除。而对于大面积存在的黑色霉菌，若采用传统的手术刀清除法可能会对壁画颜料层产生物理损害，棉签擦拭法则会将一些孢子和菌丝压入壁画内部，造成更大面积的污染，因此可选择贺东鹏、武发思等在麦积山石窟壁画微生物治理试验中卓有成效的负压清洗设备与机械清除相结合的方法，尽可能减少清洗过程对壁画基质的损害[26]。
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内部菌丝体杀灭时，考虑到壁画体量较大，且菌丝体已深入壁画地仗内部，可采用杀菌剂和展柜环境监测、控制结合的办法。在杀菌剂的选择上，由于壁画搬迁阶段使用的霉敌与克霉唑乙醇混合溶液，考虑到霉菌的耐药性以及以青霉菌为优势菌的霉菌菌落组成情况，应重新进行杀菌剂的筛选工作，以提高杀菌效果。但杀菌剂的耐药性及菌群演替变化问题使其难以单独发挥作用，因此当壁画进入保存展示阶段，为长期控制霉菌的生长繁殖，应通过安装温湿度控制装置的方式，维持展柜在温度20℃，相对湿度50%的稳定状态，并长期监测展柜内微环境变化情况及菌丝体萌发情况，以实现韩休墓壁画的常态化预防保护。
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3 结论
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1）韩休墓大型壁画霉菌鉴定结果为青霉属与枝孢属，其中青霉属为优势菌，与2015年搬迁阶段霉菌鉴定结果相比，修复阶段壁画表面霉菌多样性显著降低，优势菌青霉菌菌落组成也发生了较大变化。
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2）壁画黑色霉菌由青霉属组成，青霉菌可产生色素附着于壁画表面，使壁画产生棕色、黄色菌斑等微生物污染病害。黄色霉菌由青霉属与枝孢属组成，枝孢菌会分解壁画胶料，使壁画产生粉化、褪色等病害。青霉属中产黄青霉耐盐性强，可生长于壁画富盐表面，其产生有机酸会与壁画石灰地仗层反应，将其转化为可溶性Ca（HCO3）2，加重壁画酥碱病害。
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3）壁画霉菌治理包括表面霉菌清除、内部菌丝体杀灭以及霉菌预防等步骤，其中，表面霉菌清除可采用负压清洗设备与机械清除相结合的方法，内部菌丝体杀灭及霉菌预防可采用杀菌剂与展柜环境控制相结合的方法，以进一步提高霉菌病害治理效果。
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摘要
为评估韩休墓壁画搬迁阶段霉菌病害治理方式的有效性和长效性，研究现修复阶段霉菌病害成因及治理措施，本研究通过超景深显微镜分析霉菌病害特征，采用分子技术鉴定壁画霉菌种属，结合搬迁阶段霉菌鉴定结果、保存环境监测数据等，探究搬迁阶段霉菌治理方式对修复阶段菌群发展、演替的影响。结果表明：修复阶段壁画霉菌样品分离的11株菌株分属青霉属（Penicillium）与枝孢属（Cladosporium）。与搬迁阶段相比，壁画表面霉菌多样性显著降低，优势菌青霉菌菌落组成也存在较大差异，显示出克霉唑等防霉剂对曲霉菌、镰刀菌、交链孢菌生长的有效抑制以及青霉菌对环境的适应性与选择性。韩休墓壁画表面霉菌代谢产物作用于壁画基质，使壁画出现霉斑污染、变色等病害，且青霉菌菌丝体已深入地仗内部，对壁画结构稳定性危害极大。建议及时开展表面黄色、黑色霉菌分类清洗，杀菌剂筛选以及展柜环境监测控制等保护工作，以实现对韩休墓壁画霉菌病害的常态化治理。
Abstract
This work aimed to evaluate the effectiveness and long-term performance of mold disease control methods during relocation of murals from the tomb of Han Xiu, and to study the causes of mold diseases as well as the prevention and control measures used in the current restoration stage. The characteristics of mold diseases were analyzed using ultra depth-of-field microscopy. The community composition of fungi was identified using molecular techniques. In addition, the influences of mold control methods during relocation on the development and succession of microflora in the restoration stage was explored by combining the mold identification results in the relocation stage and the monitoring data of the preservation environment. The following results were obtained: the 11 strains isolated from the mold samples in the restoration stage belonged to Penicillium and Cladosporium; compared with the relocation stage, the diversity of molds on the mural surfaces was significantly reduced, and the composition of the dominant fungus Penicillium was also significantly different. The results also show the effective inhibition by clotrimazole and other anti-mold agents on the growth of Aspergillus, Fusarium and Alternaria, and the adaptability and selectivity of Penicillium fungi to the environment. The action of mold metabolites on the mural body caused mildew pollution, discoloration, disruption and other diseases of the murals. In addition, Penicillium mycelium had deeply entered into the interior, causing great harm to the stability of the mural structure. Therefore, it is recommended to classify and clean the yellow and black molds on the surfaces, screen mildew prevention agents and develop environmental control of exhibition cases promptly, to achieve long-term prevention and control of mold diseases of the murals from the tomb of Han Xiu.
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